Obtenção e caracterização de anticorpo monoclonal murino anti-fator VIII da coagulação sangüínea / Attainment and characterization of murine monoclonal anti-factor VIII antibodies

Entre os avanços da engenharia celular e biotecnologia nas últimas décadas, destaca-se a produção de anticorpos monoclonais murinos (AcMm) utilizados no aprimoramento diagnóstico nas rotinas laboratoriais. A produção de fator VIII de alta pureza sempre foi o desejo e a preocupação das indústrias de hemoderivados para tratamento de pacientes portadores de hemofilia A, porém este produto inexiste no Brasil, sendo necessária sua obtenção no mercado internacional a custos elevados. O trabalho tem por objetivo a produção de AcMm anti-fator VIII humano (FVIII H) através da expansão dos clones e caracterização imunoquímica do anticorpo. Camundongos Balb/c foram imunizados com FVIII H purificado como também proveniente de crioprecipitado e as células esplênicas dos animais foram fusionadas com células mielomatosas murinas segundo o método descrito por Kohler e Milstein para produção de híbridos em cultura. Foram testados 1.983 híbridos dos quais 105 foram submetidos à clonagem. Destes, 39 obtiveram monoclonalidade e 7 destes clones foram caracterizados através de técnicas de immunoblotting. Foram submetidas à purificação por cromatografia três imunoglobulinas de diferentes classes pertencentes aos clones LAMB1-10A1A4, LAMB1-17A1A1 e LAMB1-24A2A1. A imunoglobulina purificada pertencente ao clone LAMB1-10A1A4 foi adsorvida em coluna de imunoafinidade para purificação de concentrado de FVIII proveniente de crioprecipitado plasmático.

Among the advances in cellular engineering and biotechnology over the last decades, the production of murine monoclonal antibodies (AcMm), used to improve laboratory diagnoses, stands out. The production of very pure factor VIII has always been a concern of suppliers of blood products to treat patients with hemophilia A and this product is still not produced in Brazil. Hence, it can only be attained on the international market at a high cost. The aim of this work was to produce AcMm anti-factor VIII human (FVIIIh) by expanding clones and characterizing the antibodies by immunochemistry. Balb/c mice were immunized with FVIII both purified and from cryoprecipitation and the splenic cells of the animals were fused with myelomatous murine cells according to the method described by Kohler and Milstein to produce hybrids in a culture. A total of 1983 hybrids were tested and 105 were selected for cloning. Of these, 39 developed monoclonality and 7 of these clones were characterized through immunoblotting techniques. Three immunoglobulins from different classes, LAMB1-10A1A4, LAMB1-17A1A1 and LAMB1-24A2A1, were submitted to chromatography for purification. The purified immunoglobulin from the LAMB1-10A1A4 clone was adsorbed in the immunoaffinity column to purify the factor VIII concentrate coming from the plasmatic cryoprecipitate.

Freqüência de hemolisinas anti-A e anti-B em doadores de sangue do Hemocentro de Botucatu / Anti-A and anti-B hemolysin frequencies in blood donors from the Hemotherapy Center of Unesp, Botucatu

O Sistema ABO foi descoberto em 1900 e permanece até hoje como sendo o sistema mais importante dentro da prática transfusional. A transfusão ABO incorreta pode resultar na morte do paciente, com uma reação hemolítica intravascular, seguida de alterações imunológicas e bioquímicas. Os anticorpos ABO estão presentes nos soros dos indivíduos, dirigidos contra os antígenos A e/ou B ausentes nas hemácias. Embora as transfusões com pequenas quantias de plasmas incompatíveis sejam geralmente consideradas uma prática segura, alguns casos de reações hemolíticas por plasma incompatível são encontrados na literatura. Tendo em vista a pequena quantidade de estudos sobre as hemolisinas anti-A e anti-B e a importância desses anticorpos na prática transfusional, objetivamos neste trabalho verificar a freqüência dessas hemolisinas em doadores de sangue do Hemocentro da Unesp de Botucatu. Foram analisadas 600 amostras de soros de doadores do grupo "O" para presença ou ausência das hemolisinas anti-A e anti-B. Desses doadores, 77 (12,8 por cento) foram classificados como perigosos por apresentarem em seu soro altos títulos de hemolisinas e 523 (87,2 por cento) como não perigosos por apresentarem baixos títulos. No grupo dos doadores perigosos, 45 (58,4 por cento) foram reativos para hemolisina anti-A, 11 (14,2 por cento) reativos para hemolisina anti-B e 21 (27,2 por cento) reativos para ambas. O título de aglutininas superior a 1/100 já considera o doador "O" como perigoso. Assim, o teste realizado em nossa rotina é suficiente para detecção de altos títulos fazendo com que os pacientes dos outros grupos sangüíneos não corram o risco de reação transfusional se necessitarem de transfusão sangüínea não-isogrupo.

Inferferência da malária na fisiologia e na fiosiopatologia do eritrócito: parte 3: relaçäo com deficiência de G6PD, talassemias e outros aspectos hereditários do eritrócito / Malaria interference of physiologic and physiopathology of erythrocyte: part 3: relation of G6PD deficiency, thalassemis and other hereditary aspects of erythrocyte

Os autores enfocam os aspectos fisiológicos e fisiopatológicos do eritrócito que se relacionam com a malária. Esta revisäo visa compreender a açäo seletiva da malária sobre as doenças hereditárias do glóbulo vermelho (anemia falciforme e hemoglobinopatias associadas, talassemias, deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase, ovalocitose hereditária) e do sistema Duffy, focalizando a discussäo nos aspectos associados ao ciclo evolutivo do parasita no inseto e no homem. Descrevem a fisiopatologia da deficiência de G6PD, talassemias, hemoglobinopatias C e E ovalocitose, sistema Duffy e as inter-relações com a malária

Interferência da malária na fisiologia e na fisiopatologia do eritrócito: parte 2: Fisiopatologia da malária, da anemia falciforme e suas inter-relações / Malarias's interference in physiology and physiopathology of the erythrocyte: part 2: Physiophatology of malaria, sickle cell disease and hers interrelationships

Os autores enfocam os aspectos fisiológicos e fisiopatológicos do eritrócito que se relacionam com a malária. Esta revisäo visa compreender a açäo seletiva da malária sobre as doenças hereditárias do glóbulo vermelho (anemia falciforme e hemoglobinopatias associadas, talassemias, deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase, ovalocitose hereditária) e do sistema Duffy, docalizando a discussäo nos aspectos associados ao ciclo evolutivo do parasita no inseto e no homem. Os autores abordam a fisiopatologia da malária e as repercussões clínicas. A seguir, descrevem a fisiologia e a fisiopatologia da hemoglobinopatia S e as inter-relações com a malária

Interferência da malária na fisiologia e na fisiopatologia do eritrócito: parte 1: eritrócito normal e vetor / Interferency of malaria in physiology and physiopathology of the erythrocyte: part 1: normal erythrocyte and vector

Os autores enfocam os aspectos fisiológicos e fisiopatológicos do eritrócito que se relacionam com a malária. Esta revisäo visa compreender a açäo seletiva da malária sobre as doenças hereditárias do glóbulo vermelho (anemia falciforme e hemoglobinopatias associadas, talassemias, deficiência de glicose-6-fostato desidrogenase, ovalocitose hereditária) e do sistema Duffy, focalizando a discussäo nos aspectos associados ao ciclo evolutivo do parasita no inseto e no homem. Os autores descrevem a estrutura e funçäo da membrana eritrocitária, a eritropoese, a estrutura e fisiologia da molécula de hemoglobina, a oxigenaçäo tecidual, o metabolismo do eritrócito e os aspectos do óxido-reduçäo e a hemocaterese, conhecimento necessário para a compreensäo das alterações induzidas pelo parasita. Além disso, analisam aspectos do ciclo evolutivo do parasita no mosquito, e as conseqüentes interrelações do vetor com o eritrócito

Análise de regiöes repetitivas do genoma como parâmetro de avaliaçäo da "pega" do TMO-Alogênico e do Status quimérico / Analysis of repetitive regionsof the genome as a parameterfor evaluation of engraftement of allogenic bone marrow transplant and chymeric state

As VNTRs (Variable Number in Tandem Repeats) säo regiöes do genoma, näo codificadoras de proteínas, as quais constituem excelentes fontes de variabilidade genética por apresentarem alto polimorfismo no que se refere ao número de repetiçöes seqüenciais de blocos de DNA. O estudo destas regiöes pela técnica de RFLP (Restriction Fragment Lengh Polimorphism) vem se mostrando útil no monitoramento da "pega" da medula óssea pós TMO-alogênico. Foram analisadas quatro pacientes com diagnóstico de LMC em fase crônica e outro com síndrome mielodisplásica - RAEB, todos adultos, submetidos a transplante de medula óssea alogênico, HLA - idênticos e MLC-negativa. Foi possível demonstrar a "pega" da medula óssea e definir o quimerismo hematopoiético em todos os casos estudados.

Controle de qualidade de Concentrados de Plaquetas (CP) / Quality control in Platelet Concentrade (PC)

A obtençäo de hemocomponentes lábeis, seu controle e importância na prática hemoterápica tem merecido especial atençäo dos profissionais da saúde em todo mundo. Visando a atingir qualidade - Programa Hemocentro 2000 - objetivou-se estandardizar a produ_o de concentrado de plaqueta (CP) que estivesse dentro dos padröes internacionais descritos. Neste sentido, os seguintes parâmetros foram monitorados: 1) calibraçäo sistemática dos equipamentos envolvidos no processo; 2) determinaçäo do tempo ideal de coleta de sangue para produçäo de CP; 3) escolha do melhor método de determinaçäo de pH, volume e hematimetria. Os resultados obtidos levaram à reformulaçäo dos procedimentos técnicos adotados. Constatou-se que: 1) a instalaçäo do controle de qualidade no serviço gerou certa animosidade que dificultou em parte a obtençäo dos dados; 2) na validaçäo do equipamento, concluiu-se que a centrífuga produzida no Brasil näo velocidades exigidas pela técnica de calibraçäo, näo sendo , portanto, indicada para este fim; 3) foram monitorados diferentes intervalos de tempo, sendo que os CPs produzidos a partir de sangue total colhido em intervalo de tempo inferior a 8 minutos, deram os melhores resultados; 4) determinou-se o pH por três diferentes métodos: pHmetro(pHMeter HM-6A) e aparelho de gasometria NOVA Star Profile Plus 5. A determinaçäo do pH pelo método de fita, simples, rápido, de baixo custo deu os mesmos resultados dos dois métodos comparativos, sendo indicado seu uso antes da liberaçäo imediata do hemocomponente; 5) após determinaçäo de centrífuga que teve melhor desempenho, definiu-se o melhor técnico, concluindo que este corresponde ao único técnico de nível superior da equipe. Estes resultados, estatisticamente validados, apontam para indiscutível necessidade do investimento continuado para qualificaçäo de recursos humanos

Detecçäo de mRNAs quiméricos BCR/ABL em pacientes portadores de leucemia mielóide crônica, leucemia linfóide aguda/mielóide aguda pela reaçäo de polimerizaçäo em cadeia (PCR) / Detection of BCR/ABL chimeric mRNAs in patients with chronic myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia/ acute myeloid by polimerase chain reaction (PCR)

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença caracterizada pela proliferaçao e acumulaçao de células mielóides e seus precursores, induzida pela transformaçao neoplásica de uma célula hematopoética pluripotente, a stem-cell. Esse clone possui uma anormalidade citogenética que se caracteriza pela translocaçao recíproca entre os cromossomos 9 e 22 [t(9;22) (q34;q11)], resultando na formaçao do cromossomo Philadelphia (Ph1). O resultado dessa translocaçao é a justaposiçao do gene BCR com o protooncogene ABL, originando um gene híbrido que codifica uma proteína anormal com atividade tirosina quinase exacerbada. A reaçao de polimerizaçao em cadeia (PCR) baseada na amplificaçao do cDNA híbrido BCR/ABL tem sido considerada um meio altamente sensível e específico para detecçao dessa patologia, em nível molecular. O RNA total foi extraído pelo método de isocianato de guanidina, de leucócitos de sangue periférico e (ou) medula óssea. A primeira fita (cDNA) foi sintetizada utilizando primer complementar à regiao 3' do mRNA quimérico BCR/ABL, transcriptase reversa (Super Script II - Gibco-BRL) segundo sugestao do fabricante. A reaçao de PCR foi realizada em duas etapas: a primeira utilizando primers complementares à regiao BCR e ABL, num total de 25 ciclos com temperatura de 94 graus Celsius, 49 graus Celsius e 72 graus Celsius para desnaturaçao, anelamento e extensao, respectivamente; na segunda etapa foram utilizados primers internos aos primeiros (Nested-PCR) num total de 35 ciclos com temperatura de anelamento de 60 graus Celsius (primers sintetizados pela Genomic - Engenharia Molecular, SP). O controle de todo o procedimento técnico foi realizado pela amplificaçao de uma regiao do gene ABL. A presença de bandas características da LMC foram visualizadas após eletroforese em gel de poliacrilamida 6 por cento e coloraçao por brometo de etídio. O método foi considerado extremamente sensível e rápido para a detecçao da t(9;22) quando comparada com a citogenética convencional.